Cas9이란 CRISPR-Cas의 방어 방법 CRISPR 처리 / 바이오 제너레이션

 

Cas9이란?

Cas9(CRISPR 관련 단백질 9)은 DNA 바이러스 및 플라스미드에 대한 특정 세균의 면역학적 방어에 중요한 역할을 하는 160킬로달톤의 단백질로 유전자 공학 용도로 많이 이용되고 있습니다. 그 주요 기능은 DNA를 절단하고 그에 따라 세포의 게놈을 변경하는 것입니다. CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술은 엠마누엘 샤르펜티에와 제니퍼 두드나에게 2020년 노벨 화학상을 수여하는 중요한 공헌자였습니다. 보다 기술적인 Cas9은 연쇄상구균 파이오게네스에서의 CRISPR 적응 면역 시스템과 관련된 이중 RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제 효소입니다. S. pyogenes는 CRISPR을 사용하여 기억하고, Cas9은 나중에 박테리오파지 DNA나 플라스미드 DNA의 침입 등 외래 DNA를 심문하여 절단합니다. Cas9은 가이드 RNA(gRNA)의 20 뉴클레오타이드 스페이서 영역을 보완하는 부위를 확인함으로써 이 심문을 실시합니다. DNA 기질이 가이드 RNA와 상보적인 경우 Cas9은 침입 DNA를 절단합니다. 이런 의미에서 CRISPR-Cas9 메커니즘은 진핵생물에서의 RNA 간섭(RNAi) 메커니즘과 많은 유사점을 가지고 있습니다.

Cas9 단백질은 세균 면역에서 본래의 기능과는 별개로 DNA에서 사이트 지향 이중 사슬 절단을 유도하는 게놈 공학 도구로 많이 이용되고 있습니다. 이러한 단절은 많은 실험실 모델 생물에서 각각 비상동 말단 결합과 상동 재결합을 통해 유전자의 비활성화 또는 이종 유전자의 도입으로 이어질 수 있습니다. 다양한 cas9 변이체 개발에 대한 연구는 CRISPR-Cas9 게놈 편집의 한계를 극복하는 방법이었습니다. 몇 가지 예에는 Cas9 nicase(Cas9n)가 포함되는데, 이는 단일 가닥으로 절단된 SSB(Single-Strand Break) 또는 다른 PAM 시퀀스를 인식하는 변형을 유발하는 변형입니다. 아연 핑거뉴클레아제와 전사활성제님 이펙터뉴클레아제(TALEN) 단백질과 함께 Cas9은 게놈 편집 분야에서 중요한 툴이 되고 있습니다.

최근 Cas9은 가이드 RNA와 상보적인 거의 모든 배열을 절단할 수 있기 때문에 견인력을 얻고 있습니다. Cas9의 타겟 특이성은 가이드 RNA에서 유래했기 때문입니다: DNA의 상보성이며, 단백질 자체의 수정이 아닌 Cas9을 새로운 DNA를 표적으로 하도록 설계하는 것은 간단합니다. 전사 활성화와 억제를 제어하기 위해 전사 활성화 인자 또는 전사 억제 인자를 특정 DNA 배열에 배치하기 위해 Cas9 버전을 사용할 수 있습니다. 네이티브 Cas9에서는 CRISPR RNA(crRNA)와 트랜스액티베이션crRNA(tracrRNA)의 2개의 다른 RNA로 구성된 가이드 RNA가 필요합니다. Cas9 타겟팅은 단일 가이드 RNA(chiRNA) 엔지니어링에 의해 단순화되었습니다.

 

CRISPR-Cas의 방어 방법
적응

적응에는 CRISPR 궤적 내 인접한 두 개의 반복 간의 스페이서 인식과 통합이 포함됩니다. 프로트 스페이서란, 바이러스 게놈상의 스페이서에 대응하는 배열을 가리킵니다. 저장된 뉴클레오타이드의 짧은 스트레치는 프로토스페이서 근방에 존재합니다. 이것은, 프로토스페이서 인접 모티브(PAM)라고 불립니다. PAM은 DNA 조각을 얻기 위해 사용되는 인식 모티브입니다. 타입 II에서는 Cas9은 적응 중에 PAM을 인식하고 기능 스페이서를 확실하게 취득합니다. 스페이서의 상실이나 몇몇 그룹조차도 앨러너즈 등에 의해 관찰되고 있습니다. 아마도 반복 간 물질의 상동적 재결합에 의해 발생할 것입니다.

 

CRISPR 처리 / 바이오 제너레이션

CRISPR 발현에는 CRISPR RNA(pre-crRNA)라고 불리는 주요 전사체의 전사가 포함됩니다. 이것은 RNA 중합효소에 의해 CRISPR 자리에서 전사됩니다. 그 후, 특정 엔드리보뉴클레아제는 pre-crRNA를 작은 CRISPRRNA(crRNA)로 절단합니다.

 

간섭

간섭에는 CASCADE라고 불리는 멀티 단백질 복합체 내의 crRNA가 관여합니다. 이 복합체는 상보적인 외부 DNA를 삽입하는 영역을 인식하고 구체적으로 베이스 페어가 될 수 있습니다. 이후 crRNA-외래핵산 복합체는 절단되지만 스페이서와 표적 DNA 사이에 불일치가 있는 경우 또는 PAM에 변이가 있는 경우 절단이 시작되지 않습니다. 후자의 시나리오에서는 외부 DNA는 세포에 의한 공격의 표적이 되지 않기 때문에 바이러스 복제가 진행되고 숙주는 바이러스 감염에 대해 면역이 없습니다. 간섭 단계는 CRISPR의 획득 및 표현과는 기계적으로나 시간적으로 구별할 수 있지만, 방위 시스템으로서 완전히 기능하기 위해서는 3개의 단계 모두가 기능하고 있어야 합니다.

스테이지 1: CRISPR 스페이서의 통합입니다. protospacer 및 protospacer 관련 모티브는 호스트 DNA의 CRISPR 어레이의 리더 측에서 취득됩니다. CRISPR 어레이는 스페이서 시퀀스로 구성되며 그 옆에는 반복(검은 다이아몬드)가 배치되어 있습니다. 이 프로세스에는 Cas1 및 Cas2가 필요합니다. 이것들은, 통상, CRISPR 어레이의 근처에 배치되어 있는 Caslocus 로 부호화됩니다.

스테이지2 : CRISPR 표현입니다. pre-crRNA는 호스트 RNA 중합효소에 의해 리더 영역에서 전사되며, Cas 단백질에 의해 단일 스페이서와 부분적인 반복을 포함하는 작은 crRNA로 분할됩니다.

스테이지3: CRISPR 간섭.착신하는 외래 DNA에 강한 상보성을 가지는 스페이서를 가지는 crRNA는 Cas 단백질을 필요로 하는 절단 이벤트를 개시합니다. DNA의 절단은 바이러스의 복제를 방해하고 숙주에게 면역을 줍니다. 간섭 스테이지는 CRISPR의 취득 및 식과는 기능적으로나 일시적으로 구별할 수 있습니다.

 
 

dCas9에 의한 전사의 간섭

Cas9은 어떤 게놈의 어떤 보체 배열에도 본질적으로 결합하는 독특한 능력 때문에 연구자들은 이 효소를 사용하여 다양한 게놈 위치의 전사를 억제하고자 했습니다. 이를 달성하기 위해 RuvC 도메인과 HNH 도메인의 두 가지 중요한 촉매 잔기를 Cas9의 모든 엔도뉴클레아제 활성을 폐지하는 알라닌으로 변이시킬 수 있습니다. '죽은' Cas9 또는 'dCas9'이라는 합성 단백질은 dsDNA와 밀접하게 결합할 수 있습니다. 이 촉매적으로 비활성인 Cas9 변이체는 Cas9 DNA 질문 결합의 기계학적 연구와 일반적인 프로그래머블 DNA 결합 RNA-단백질 복합체에 모두 사용됩니다.

dCas9과 표적 dsDNA의 상호작용은 매우 긴밀하며, 고분자성 요소 단백질 변성제는 dCas9 RNA-단백질 복합체를 표적 dsDNA로부터 완전히 분리할 수 없습니다. dCas9는 전사를 정지하기 위해 프로모터에서 RNA 중합효소와 경쟁할 수 있는 모든 장소의 전사 시작 부위에 엔지니어링된 단일 가이드 RNA를 표적으로 하고 있습니다. 또한 dCas9는 전사 신장 단계에서 RNA 중합효소의 저해가 일어나도록 위치 코딩 영역을 표적으로 할 수 있습니다.진핵생물에서는 dCas9을 표적으로 특정 유전자 발현의 음소거로 이어지는 전사인자의 집합을 dCas9이 차단함으로써 유전자 발현의 음소거를 확장할 수 있습니다. 게다가 dCas9에 제공되는 가이드 RNA는 그 보완적인 코그네이트 배열에 대한 특정 미스매치를 포함하도록 설계할 수 있습니다.이는 프로그램된 코그네이트 배열에 대한 dCas9의 상호작용을 정량적으로 약화시킴으로써 연구자가 관심 있는 유전자에 적용되는 유전자 사이렌싱의 범위를 조정할 수 있습니다. 이 기술은 유전자 발현이 RNA 수준에서 변조되는 것처럼 RNAi와 원리적으로 유사합니다. 하지만 dCas9의 접근법은 RNAi 스크린에 비해 타겟 외 효과가 적고, 일반적으로 dCas9의 사용으로 인한 더 크고 재현성 높은 소음 효과가 존재하기 때문에 많은 견인력을 얻고 있습니다.게다가 유전자 사이렌싱에 대한 dCas9 접근법은 정량적으로 제어할 수 있기 때문에 연구자들은 현재 관심 있는 유전자가 어느 정도 억제되는지 정확하게 제어할 수 있고 유전자 조절과 유전자 화학량론에 대한 더 많은 질문에 답할 수 있습니다.

dCas9을 전사에 민감한 위치에 직접 결합할 뿐만 아니라 dCas9은 다양한 조절 단백질 도메인에 융합하여 무수히 많은 기능을 수행할 수 있습니다. 최근 dCas9은 크로마틴 리모델링 단백질에 접목하여 다양한 부위의 크로마틴 구조를 재구성하고 있습니다. 헤테로크로마틴 구조가 Cas9 결합을 저해하기 때문에 이는 관심 있는 다양한 진핵생물 유전자를 표적으로 하는 데 중요합니다. 게다가 Cas9은 헤테로크로마틴에 반응할 수 있기 때문에 이 효소는 다양한 로케이션의 크로마틴 구조 연구에 더욱 응용될 수 있다고 이론화되어 있습니다. 또한 dCas9은 유전자 억제 게놈 와이드 스크린에 채택되어 있습니다.